全氟化合物(perfluorinatedcompounds,改进PFCs)是改进化合物分子巾与碳原子连接的氢原子全部被氟原子取代并带有不同功能团的一类人工合成有机化合物。PFCs主要包括全氟烷基羧酸类(PFCAs)、改进全氟烷基磺酸类(PFSAs)、改进全氟烷基磺酰胺类(PFOSAs)、改进全氟调聚醇(FTOHs)、改进全氟磷酸及其酯等,改进其中全氟烷基辛酸(PFOA)和全氟烷基磺酸(PFOS)是改进两种最受关注的八碳链PFCs。全氟化合物的改进C-F共价键具有极高的化学键能,不易被水解、改进光解或生物降解,改进可在环境中持久性存在、改进可长距离传输、改进可沿生物链积累放大,改进是改进国际上备受关注的新型有机污染物。近年来,在全球生态环境系统、生物体、人体、食品等多种介质中均有检出。鉴于PFCs广泛存在性以及具有神经毒性、生殖毒性和免疫毒性等毒性效应,国内外研究学者开始关注PFCs对人体的健康风险,并普遍认为膳食暴露是人类摄入PFCs的重要途径。
人类膳食中水产品、乳及乳制品、肉及肉制品、果蔬等均有不同程度PFCs污染。尽管人们已经认识到PFCs可能带来的膳食摄入风险,但国内外关于食品中PFCs的限量标准仍是空白。基于PFCs易与蛋白质结合而累积于生物体组织器官的富集特性,膳食占比较大的动物源性食品,特别是肝脏、肾脏、肌肉等蛋白质含量较高的器官组织中寓集现象普遍但含量较低(通常在μg/kg级别)。因此,快速、准确、灵敏的动物源性产品中多种类PFCs含量的检测方法可以为人群暴露于PFCs风险评估提供重要技术支持。
目前,PFCs检测方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱质谱法(GC-MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。基于PFCs极性大、沸点高、不能直接气化的特点,GC、GC-MS、GC-MS/MS法在分析前需要对PFCs进行衍生化,但处理过程繁琐,易引入污染和干扰物质,这使得上述三种方法在应用上受到局限。HPLC-MS/MS的多反应监测模式(multi-reactionmonitoring,MRM),背景干扰少,选择性好、检出限低,在痕量PFCs检测分析中具有显著优势。HPLC-MS/MS对应的前处理方法,主要采用离子对液液萃取、液固萃取、碱消解提取结合弱阴离子交换柱WAX或HLB固相萃取柱净化,但是这些传统的前处理方法步骤多、耗时长,重现性差。本实验采用酸化乙腈提取辅以分散固相萃取技术(QuEChERS)进行样品前处理。QuEChERS是目前广泛应用于食品中目标物测定的方法,也已逐步应用到动物源性食品中PFCs检测,郭萌萌等采用十八烷基键合硅胶(C18)和石墨化碳黑(GCB)分散固相萃取法测定水产品中23种全氟化合物,朱萍萍等、何建附等、白文荟等采用C18、GCB和N-丙基乙二胺(PSA)3种混合吸附剂净化法测定羊肝、牛肝、猪肝和猪肉中多种全氟化合物。上述改进的QuEChERS-LC-MS/MS方法都具有合理的回收率及较高的灵敏度,但存在样品基质类型不全或检测项日少等缺点。我国人群膳食暴露频繁且PFCs寓集普遍的动物源性食品(猪、牛、羊)的肝脏、肾脏、肌肉中PFCAs和PFSAs多种类PFCs同时检测的方法报道较少。同时,国内外颁布的检测方法标准也只关注了食品中最典型的PFOA和PFOS,而对同样具有危害性的其它PFCs没有涉及。因此,本实验采用酸化乙腈提取,C18、GCB和PSA混合吸附剂分散同相萃取净化,UPLC-MS/MS检测9种基质(猪、牛、羊的肝脏、肾脏、肌肉)13种PFCs(包括9种PFCAs,4种PFSAs),同位素内标法定量。该方法步骤简化、定量准确、灵敏度高,可广泛应于动物源性食品中多种PFCs的分析。
甲醇、乙腈、正己烷色谱纯,德国Merck公司;甲酸、乙酸铵色谱纯,美国FisherChemical公司;盐酸、氯化钠优级纯,天津康科德公司;C18、GCB40~60μm,北京迪马公司;PSA40~63μm,上海安谱公司;聚丙烯离心管15、50mL,美国ThermoFisherScientific公司;标准品全氟丁烷羧酸(PFBA)、全氟戊烷羧酸(PFPeA)、全氟己烷羧酸(PFHxA)、全氟庚烷羧酸(PFHpA)、全氟辛烷羧酸(PFOA)、全氟壬烷羧酸(PFNA)、全氟癸烷羧酸(PFDA)、全氟十一烷羧酸(PFUdA)、全氟十二烷羧酸(PFDoA)、全氟己烷磺酸钠(PFHxS)、全氟辛烷磺酸钠(PFOS)、全氟癸烷磺酸钠(PFDS)、全氟十二烷磺酸钠(PFDoS)、同位素内标物13C4-PFOA(Perfluoro-n-[1,2,3,4-C4]octanoicacid,MPFOA)、同位素内标物C4-PFOS(Sodiumperfluoro-1-[1,2,3,4-C4]octanesulfonate,MPFOS)均为50μg/mL标准储备液,溶剂甲醇,阴凉避光放置,加拿大Wellington公司;实验所用的动物源性食品均为市售猪、牛、羊的肝脏、肾脏、肌肉,取可食用部分绞碎并均质,取2.00g均质样品于50mL聚阿烯离心管中,待检,其余样品密封保存于-18℃冰箱中。
UltiMate3000超高效液相色谱仪、TSQQuantiva三重串联网极杆质谱仪:美国ThermoFisherScientific公司;T25数显型高速分散机、Vortexgenius3涡流混合器:德国IKA公司;TD25-WS离心机:湖南湘仪公司;THZ-98A恒温振荡器:上海一恒公司;L-119A氮气吹干仪:北京来亨科贸有限公司;BiofugeStratos俞式高速冷冻离心机:美国ThermoFisherScientific公司。
13种PFCs和2种同位素内标标准中问液的配制:分别准确移取13种PFCs、2种同位素内标标准储备液(50μg/mL)适量于10mL容最瓶中,甲醇定容,分别配制成浓度均为5μg/mL的标准中问液,浓度以全氟烷基羧酸或全氟烷基磺酸计,-18℃避光保存,有效期12个月。
混合标准工作液的配制:分别准确移取13种PFCs标准中间液各1mL,于50mL容量瓶中,甲醇定容。该溶液中每种PFCs浓度为100ng/mL。-18℃避光保存,有效期3个月。
混合同位素内标中问液的配制:分别准确移取同位素内标中间液MPFOA1.5mL、MPFOS3mL,于50mL容嚣瓶中,甲醇定容。该溶液中MPFOA浓度为150ng/mL、MPFOS浓度为300ng/mL。-18℃避光保存,有效期6个月。
混合同位素内标工作液:准确移取混合同位素内标中间液1mL于10mL容量瓶中,甲醇定容。该溶液中MPFOA浓度为15ng/mL、MPFOS浓度为30ng/mL。一18℃避光保存,有效期3个月。
系列标准工作溶液的配制:准确移取13种PFCs混合标准工作液、混合同位素内标工作液适量,用甲醇配制浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ng/mL(同位素内标MPFOA浓度为1.5ng/mL、MPFOS浓度为3.0ng/mL)的系列标准工作溶液。MPFOA是定量9种PFCAs的同位素内标,MPFOS是定量4种PFSAs的同位素内标。
色谱柱:AtlantisT3色谱柱(2.1mmx150mm,3μm);流速:0.3mL/min;柱温:40℃;进样量:10μL;流动相:2.5mmol/L乙酸铵-甲醇溶液(A)(2.5mmol/L乙酸铵溶液(B);梯度洗脱程序:0~3min,90%~40%B;3~12min,40%~10%B;12~14min,10%B;14~14.5min,10%-90%B;14.5~18min,90%B。
电喷雾离子源(ESI);扫描方式:负离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);喷雾电压:3500V;蒸汽温度;290℃;离子传输管温度:270℃;鞘气流速:30arb;辅助气流速:10arb;二级碰撞气:氩气;碰撞气压力:1.5mTorr;保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量见表1。
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